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      產品中心 > 熒光定量PCR Mix > HS Probe qPCR Mix with UDG (P2301-P2302-P2303-P2304-P2305)

      HS Probe qPCR Mix with UDG (P2301-P2302-P2303-P2304-P2305)

      促銷: 490.00~29800.00

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      P2301(1ml) P2302(1mlx5) P2303(1mlx10) P2304(1mlx50) P2305(1ml×100)

      HS Probe qPCR Mix with UDG

      Cat. #P2301,P2302,P2303,P2304,P2305

       

      產品簡介

      HS Probe qPCR Mix with UDG用于探針法實時定量PCR2×濃縮預混液,使用時只需加入模板、引物和探針即可進行反應。本品含有類抗體技術修飾的熱啟動酶Hotstart Taq DNA聚合酶,配合東盛特制的Real Time PCR Buffer,不僅有效抑制引物二聚體和其他非特異性擴增,而且能夠提高擴增效率,可以進行高靈敏度高特異性的PCR反應。該試劑引入了 dUTP/UDG 防污染系統,可以在PCR反應前清除含dUTPPCR產物,有效避免因擴增產物的交叉污染對定量的影響。本品在寬廣的定量域內具有良好的線性關系,對靶基因定量準確、可信度高,重復性好。本品可搭配TaqMan等各類熒光探針使用,與常見定量PCR儀完美兼容,如ABI、Roche、Bio-Rad等。

      產品組成

      Component

      P2301

      P2302

      P2303

      P2304

      P2305

      2× HS Probe qPCR Mix with UDGa

      1 ml

      1 ml×5

      1 ml×10

      1 ml×50

      1 ml×100

      超純水

      1 ml

      1 ml×5

      -

      -

      -

      a 包含Hotstart Taq DNA聚合酶,dNTP/dUTP Mix,UDGUracil-DNA Glycosylase,尿嘧啶DNA糖基化酶)及反應緩沖液等。

      保存條件

      -20℃保存2年,4℃可短期保存。

      質量控制

      純度檢測:經質量檢測,產品不含脫氧核糖核酸內切酶、脫氧核糖核酸外切酶和核糖核酸酶污染。

      功能檢測:經不同來源的模板和引物檢測,產品具有優秀的特異性、靈敏性及可重復性等。

      應用舉例

      1. 配制反應體系

      請于冰上配制以下反應體系:

      Component

      Volume

      Final concentration

      DNA template[1]

      1-4 μl

      Variable

      Forward primer (10 μM)[2]

      0.4 μl

      0.2 μM

      Reverse primer (10 μM)[2]

      0.4 μl

      0.2 μM

      2× HS Probe qPCR Mix with UDG

      10 μl

      1×

      Probe (10 μM)[3]

      Variable

      0.1-0.5 μM

      ddH2O

      Variable

      -

      Total volume[4]

      20 μl

      -

      [1] DNA模板建議用量(20 μl體系):1-10 ng cDNA,或10-100 ng gDNA。加樣體積不宜過小,以免造成較大的誤差,但未稀釋的cDNA不宜超過總體積的1/10。因此模板建議濃度(加樣前):cDNA 1-10 ng/μl,gDNA 10-100 ng/μl。

      [2] 引物終濃度建議范圍:0.1-1.0 μM, 通常引物終濃度為0.2 μM效果較好。

      [3] 使用探針的濃度與Real Time PCR擴增儀、探針種類和熒光標記物種類有關,使用時請參照相關說明。通常探針終濃度在0.1-0.5 μM之間。

      [4] 建議總體積不小于10 μl,以免造成較大的加樣誤差。具體體積范圍參考儀器說明。

      注意:對于某些固定型號的儀器,需要添加ROX才能精確測定Ct值。由于ROX的使用體積較小,建議將ROX提前與qPCR Mix混勻使用。ROX用量參照具體儀器說明,下表僅供參考。

      Instruments

      ROX (100X)

      ABI PRISM 7000/ PRISM 7700/ 7300/ 7900HT/ Step One/ Step One Plus/ GeneAmp 5700

      1-2% (High ROX)

      ABI 7500/ 7500 Fast/ ViiA 7/ QuantStudio 6/7/12K Flex; Agilent Stratagene Mx3000P/ Mx3005P/ Mx4000

      0.2% (Low ROX)

      Bio-Rad CFX96/ CFX384/ iQ/ iQ5; MJ Research Opticon 2/ Chromo 4; Roche LightCycler 480/ 96; Corbett Rotor Gene G/ Q/ 3000/ 6000; Thermo PikoReal 96; Eppendorf MasterCycler ep realplex; Cepheid Smart Cycler

      No ROX

      2. 設定反應程序進行qPCR反應

      步法程序示例如下:

      Stage

      Temperature

      Time

      Cycle

      UDG pre-treatment

      37

      2 min

      1

      Initial denaturation

      95

      3 min

      1

      Denaturation

      95

      10 sec

      40

      Annealing & Extension[1]

      60

      30 sec

      [1] 儀器在此階段進行信號采集。請根據儀器類型設置反應時間。如需優化溫度,建議在55-65范圍內調整。

      若反應效果不佳,建議采用三步法擴增程序。

      經典三步法程序示例如下:

      Stage

      Temperature

      Time

      Cycle

      UDG pre-treatment

      37

      2 min

      1

      Initial denaturation

      95

      3 min

      1

      Denaturation

      95

      10 sec

      40

      Annealing[1]

      60

      15 sec

      Extension

      72℃

      20 sec

      [1] 儀器在此階段進行信號采集。常用退火溫度在55-65℃之間。退火溫度一般設定為所用引物的Tm-5℃,若低于55℃,則以Tm值為退火溫度,一般不低于55℃。請根據儀器類型設置反應時間。 

      3. 分析結果

      觀察擴增曲線;調整基線,計算Ct值;進行相對或絕對定量。

      注意事項

      1 使用前Mix需要完全解凍,充分混勻。盡量避免多次反復凍融。短期使用可保存于4℃。

      2 將(n+x)份反應液混勻后再分注到n個單管中,可降低加樣誤差。(n為重復次數,x為損耗量,一般為n1/10

      3 ABI的定量儀器大部分需要ROX校正管間差異,Bio-Rad的定量儀器不需要ROX校正。具體儀器請參照其使用說明。

      4 輕輕混勻反應液,避免產生氣泡,氣泡會干擾熒光檢測??伤矔r離心去除氣泡。

      5 引物的特異性、用量以及退火溫度是影響實驗結果的重要因素。務必設計特異性好的引物,隨實驗結果適當調整引物用量(0.1 μM-1.0 μM——特異性較差時減少引物用量,或以3℃為增量提高退火溫度,擴增效率較低時增加引物用量。

      6 DNA模板的量應小于500 ng/反應,過高的模板量會引起非特異性擴增。應根據模板類型與基因表達量適當調整用量。

      7 各類探針應參照相應的指南進行設計,并根據所用擴增儀類型、探針種類和熒光標記物種類等調整用量。

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      貨號

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