高純度質粒小量提取試劑盒
產品組分
貨號 | N1011 （50次） | N1012 （100次） | N1013 （200次） |
RNase A | 150 μl | 300 μl | 600 μl |
溶液Ⅰ | 15 ml | 30 ml | 60 ml |
溶液Ⅱ | 15 ml | 30 ml | 60 ml |
溶液Ⅲ | 20 ml | 40 ml | 80 ml |
溶液PB | 30 ml | 50 ml | 100 ml |
溶液W | 30 ml | 30 ml×2 | 40 ml×3 |
溶液Eluent | 5 ml | 10 ml | 20 ml |
DNA純化柱 | 50個 | 100個 | 200個 |
說明書 | 1份 | 1份 | 1份 |
● RNase A的濃度為10 mg/ml。
● 溶液W初次使用前用無水乙醇按1: 1.5稀釋，即含60%乙醇。
● 溶液Ⅱ、溶液Ⅲ、溶液PB中含有堿及蛋白變性劑，請不要直
接接觸皮膚。
● 上述產品組分均可單獨購買，詳見產品索引。
產品說明
本產品采用了經典的硅膠膜及堿裂法技術，可用于質粒DNA的小量純化。其純化原理是堿裂解細菌后，硅膠膜柱高效可逆地吸附體系中的質粒DNA（高鹽、低pH值），同時去除蛋白及其它雜質，被吸附的DNA在低鹽、高pH值條件下再被洗脫純化出來。一次可從1-5ml過夜培養的菌液中提取10-40 μg高純度質粒DNA（OD260/280 = 1.7-1.9），此質粒DNA可直接用于DNA序列分析以及各種酶促反應等。
質量控制
從大腸桿菌提取pGEM質粒DNA。提取的質粒DNA質量通過瓊脂糖凝膠電泳、限制性酶切和序列測定分析。
保存條件
本產品除RNase A外，其余組分可室溫保存1年以上。RNaseA
為渾濁溶液，室溫運輸，-20℃保存。初次使用本試劑盒時，請
將RNase A 全部加入到溶液Ⅰ中，均勻混合后于4℃可保存6
個月。
若溶液Ⅱ出現沉淀，請于37℃保溫溶解，待恢復至室溫后使用。沉淀的出現不會影響質粒DNA的純化結果。
注意事項--------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
● 溶液Ⅰ在使用前先加入RNase A（將試劑盒中提供的RNase A全部加入），混勻后4℃保存，可保存6個月.
● 溶液W第一次使用前應按照試劑瓶標簽的說明加入無水乙醇，即30 ml溶液W中加入45 ml無水乙醇，用后立即蓋緊蓋子。
● 若溶液Ⅱ出現沉淀，請于37℃保溫溶解，待恢復至室溫后使用。沉淀的出現不會影響質粒DNA的純化結果。
● 注意不要直接接觸溶液Ⅱ和溶液Ⅲ，使用后立即蓋緊蓋子。
● 提取的質粒量與細菌培養濃度、質?？截悢档纫蛩赜嘘P。如為高拷貝質粒，建議使用2 ml菌液，可提取10-15 μg質粒。低拷貝質?；虼笥?/span>10 kb質粒，建議使用5-10 ml菌液（按照比例增加溶液Ⅰ、溶液Ⅱ、溶液Ⅲ的用量），可提取4-6 μg質粒。溶液Eluent 應在65℃水浴預熱，在吸附和洗脫時可以適當的延長時間，以增加提取效率。其它步驟相同。
● 本產品適用于革蘭氏陰性菌與革蘭氏陽性菌中的質粒DNA提取。由于革蘭氏陽性菌外被一層較厚的細胞壁，會嚴重影響堿裂解細菌細胞的效率。因此，必須在堿裂解細胞前用溶菌酶（N9021）消化細胞壁。處理方法為：離心收集適量菌體，棄上清，加入250 μl溶液Ⅰ，充分振蕩懸浮菌體。加入溶菌酶使其終濃度為10-20 mg/ml左右，37℃處理30min。溶菌酶的濃度和處理時間可根據菌株的不同與具體的實驗條件加以調整。
● 所有離心步驟均為使用常規臺式離心機室溫下進行離心，速度為12,000 rpm。
● 溶液Eluent（10 mM Tris-HCl, pH 8.5）中不含EDTA，其收集的DNA片段可直接用于各種酶促反應等，不會影響后續試驗。
● 為了保證回收效率，請不要使用未調整pH值的超純水洗脫目的片段。
● 請嚴格遵照操作步驟操作。
操作步驟--------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
1 用1.5 ml離心管收集1-5 ml菌液。12,000 rpm離心1min，棄上清。
● 應根據所培養菌體的濃度與質粒的拷貝數，確定收集的菌液量。菌量過大可能導致溶菌不充分，純化
時影響質粒純度。菌體的體積與質?？截悢祬⒁娮⒁馐马?。
2 加入250 μl溶液Ⅰ/RNase A混合液，渦旋劇烈振蕩直至菌體完全重新懸浮。室溫靜置1-2min。
● 初次使用本試劑盒時，請將RNase A全部加入到溶液Ⅰ中，均勻混合后于 4℃保存?？杀４?/span>6個月。
● 不要殘留細小菌塊。菌體懸浮充分與否將決定質粒DNA得率的高低。
● 室溫靜置1-2 min是為使溶液中的RNA被充分降解。
3 加入250 μl溶液Ⅱ，輕柔地反復顛倒混勻5-6次。室溫放置1-2 min，使菌體充分裂解，直至形成澄清的裂解溶液。
● 若溶液Ⅱ出現沉淀，請于37℃保溫溶解。待恢復至室溫后使用。沉淀的出現不會影響質粒DNA的純化結果。
● 不可劇烈混合，否則會使染色體DNA斷裂，造成基因組污染。
● 此步驟不宜超過5 min。
4 加入350 μl溶液Ⅲ，立即輕柔地反復顛倒混勻5-6次。此時會出現白色絮狀沉淀。
5 12,000 rpm室溫離心10 min，收集上清。
6 將上清置于DNA純化柱中，靜置1-2 min。
● 如果收集的上清液過多，超過DNA純化柱容積（700 μl），可將上清分次加入DNA純化柱中。
7 12,000 rpm離心1 min，棄濾液。
● 此時質粒DNA被吸附于DNA純化柱的硅膠膜上。
8 加入500 μl 溶液PB，12,000 rpm離心1 min，棄濾液。
● 此步驟的作用是將硅膠膜上吸附的蛋白、鹽等雜質洗脫，以獲得高質量質粒DNA。
9 加入500 μl溶液W，12,000 rpm離心1 min，棄濾液。
● 溶液W初次使用前用無水乙醇按1: 1.5稀釋，即含60%乙醇。
10 加入500 μl溶液W，12,000 rpm離心1 min，棄濾液。
11 12,000 rpm離心3min，以徹底去除純化柱中殘留的液體。
12 將DNA純化柱置于新的離心管中。向純化柱中央處，懸空滴加50-100 μl溶液Eluent，室溫放置2 min。12,000 rpm離心1 min，管底即為高純度質粒DNA。質粒DNA于-20℃保存。
● 溶液Eluent可用無菌雙蒸水代替，但其pH需為8.0-8.5。溶液Eluent的加入體積視質?？截悢刀?/span>
少、用戶對質粒濃度要求而定。對溶液Eluent 65℃預熱,會提高提取質粒的產量。
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